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原位合成的基因芯片制備技術

來源:生物谷  2010/1/8   訪問量:3901
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生物芯片制備中材料的固定方式主要包括原位合成法和點樣法兩種,點樣法又分為接觸式點樣法和非接觸式點樣法。原位合成法主要用于基因芯片的制備,點樣法可用于基因芯片和蛋白質芯片的制備。細胞芯片主要是通過細胞本身的貼壁生長來完成固定。組織芯片通過一些黏性溶劑(如石蠟)使組織切片固定在載體上。某些微流體芯片不需要材料的固定,只是通過硅材料上大量的微通道來完成檢測,另外一些微流體芯片通過特殊的作用(如蛋白質的特異性結合、序列互補DNA片斷等)把材料固定在微粒上來完成檢測。在此我們主要介紹原位合成技術和直接點樣技術。

    原位合成是直接在固體基質上用4種單核苷酸合成所需的DNA片段。Affymetrix公司的GeneChipTM是高密度寡核苷酸微陣列原位合成的代表,制造工藝采用原位光刻合成。其他原位合成制造工藝還有光敏抗蝕層并行合成法、微流體通道在片合成法、噴印合成法及分子印章在片合成法。
    原位合成芯片是指將多個寡核苷酸片段用單核苷酸底物直接合成到載體的特定位置上制備的芯片,主要包括以下幾種制備方法。
    1.Affymetrix公司的方法
    它是將光平版印刷技術(photolithographicapproach)運用到DNA合成化學中,利用固相化學、光敏保護基及光刻技術得到位置確定、高度多樣性的化合物集合。該法利用光敏保護基來保護堿基單位的5’羥基。第一步利用光照射使固體表面上的羥基脫保護,然后固體表面與光敏保護基保護、亞磷酰胺活化的堿基單體接觸,合成只在那些脫保護基的地方進行。光照區域就是要合成的區域,該過程通過一系列掩膜來控制。如此循環以合成寡核苷酸,直到設定的寡核苷酸長度。每個寡核苷酸片段代表了一種特定的基因存在于DNA芯片的特定位置上,可合成任意序列15—25個堿基長度的片段。這種方法可使每cm2上的探針數量達到106個,每種探針為5~10btm的方形區域,探針的間距約為20btm。這種方法的最大的優點就是可以在較小的區域內制造大量不同的探針,如1cm2可以有400 000種探針。后來由于運用了非線性半導體光抗技術(non—linear semicondutor photoresist technology),而使探針的間距更加微小。目前Affymetrix公司已有可以同時檢測人類全基因組的表達譜基因芯片及檢測高達50萬個SNP的基因芯片。
    2.第二種方法
    通過機械手臂直接將堿基合成試劑氨基膦酸酯點樣到芯片適當的位置上,循環下去就能合成預計的寡核苷酸。由于這種方法靈活性高,能合成任意寡核苷酸片段,因此有應用潛力。美國Agilent公司便是利用噴墨的原位合成技術合成了60個堿基的寡核苷酸芯片產品。
    3第三種方法
    用物理方法如掩蔽體來限定前體物質的位置,將前體物通過正交管道只需幾步就能合成選定長度的所有相關序列的陣列。還有一種方法,用微型電極矩陣來對特定位置上延伸的寡核苷酸鏈進行去保護,矩陣與堿基合成試劑的反應使已去保護的寡核苷酸處添加一個堿基,從而得以延伸。這類方法不能在任意位置合成不相關的寡核苷酸,因此只能用于分析DNA多態性等基因型分析,不適合進行基因表達譜的監控。中國東南大學發明了分子印章法原位合成DNA,即采用涂有單核苷酸的印章多次壓印在同一位置上。
    4.美國NimbleGen公司的原位合成技術
    用獨特的光導合成化學結合無掩膜陣列合成技術(MAS)。MAS系統包括無掩膜的光發射機、反應腔、DNA合成儀和電腦等,系統的核心是一個數碼微鏡裝置(digital micromlrror device,DMD),創造了虛的掩膜代替傳統的物理掩膜。這些“虛的掩膜”能反射紫外光的模式,該模式通過選擇性地在精確位置上切割紫外標記的保護基團來去保護新生寡核苷酸,并使下一個堿基加上去。這種方法可以合成長達60個堿基的寡核苷酸片段,一張芯片上可以合成38萬個寡核苷酸。

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